本发明提供一种兽用疫苗佐剂、制备方法及其应用，兽用疫苗领域。所述兽用疫苗佐剂，包括分别负载有重组CTA1‑DD蛋白和PGN多肽的羧甲基壳聚糖‑硫酸葡聚糖纳米颗粒，所述重组CTA1‑DD蛋白的序列如SEQ ID NO:3所示，PGN多肽的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供所述佐剂的制备方法和含有所述佐剂的疫苗。本发明将重组CTA1‑DD蛋白和PGN多肽分别包裹成纳米颗粒进行体内递送，发挥佐剂作用，显著提高了疫苗的免疫效果，提高动物体内的血清抗体和黏膜抗体水平。本发明兽用疫苗佐剂的制备方法，该方法简单，效率高，成本低。