本发明公开了一种键合型亚胺类三组分球形COF基固定相及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：S1：合成含炔基键合臂的亚胺类三组分球形COF；S2：将单取代6‑叠氮‑6‑脱氧‑3,5‑二甲氧基苯氨基甲酰化β‑环糊精通过点击化学的方法键合到步骤S1制得的三组分球形COF上，制得键合型亚胺类三组分球形COF基手性固定相。本发明的键合型亚胺类三组分球形COF基固定相合成过程简单、方便，且制得的键合型亚胺类三组分球形COF基固定相稳定性好，在HPLC分离上有良好的应用前景。