本发明公开了一种快速检测烟草脉斑病的引物及其应用，涉及基因工程技术领域，根据PVY病毒和TVBMV病毒的外壳蛋白区段设计特异性引物对及探针。烟草脉斑病常为PVY病毒和TVBMV病毒复合侵染，本发明经过优化和摸索实验条件建立同时检测PVY病毒和TVBMV病毒复合侵染的方法，极大地提高检测效率，降低检测成本，该方法已成功地应用于室内和田间PVY病毒和TVBMV病毒复合侵染导致烟草脉斑病的同步检测，本研究也再次证明多重RT‑RAA‑LFS是一种检测植物病毒的有效手段。