本发明公开了人绒毛膜促性腺激素β亚单位含量检测方法及试剂盒，其中，检测方法包括配备试剂盒；用石英针生物传感器完成第一次反应后读数，读取第一次读取信号；将石英针放入试剂盒中清洗后，继续将石英针生物传感器完成第二次反应后读数，读取第二次读取信号；对不同浓度的校准品重复读取并记录每个浓度的校准品的第一次读取信号和第二次读取信号；根据第一次读取信号和第二次读取信号依次获得高浓度段信号标准曲线和低浓度段信号标准曲线；检测待测样本的信号值，并利用高浓度段信号标准曲线和/或低浓度段信号标准曲线对待测样本进行回算得到其浓度。本方案实现了人绒毛膜促性腺激素β亚单位含量检测的简便性、检测结果的稳定性和准确性。