本发明公开了一种二维液相色谱法同时测定保健食品中水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B含量的方法，包括：将待测样品经溶剂超声提取后得提取液，提取液通过二维高效液相色谱仪检测，在线中心切割，采用外标法定量。本发明方法基于在线中心切割的二维液相色谱法对样品中的水飞蓟宾、葛根素和丹酚酸B进行分离，解决了成分复杂的保健食品在不同的流动相系统下，丹酚酸B存在杂质峰干扰的问题，提高了丹酚酸B的分离度及准确性，并且二维的检测是在线同步进行的，这大大提高了检测效率。