本发明公开了一种从微生物酵液中分离提纯环二肽的方法，涉及环二肽制备领域。该方法包括以下步骤：S1：从解淀粉芽孢杆菌W1发酵液除去菌体，得到上清液，除去菌体时采用离心法；S2：对上述S1中得到的上清液进行吸附处理，并进行洗脱，洗脱后得到洗脱液；S3：将上述S2中得到的洗脱液进行减压浓缩处理，得到粗提取物；S4：将上述S3中得到的粗提取物悬于温水中，并进行萃取，将萃取液浓缩蒸干得到环二肽粗品；S5：对上述S4中得到的环二肽粗品进行吸附处理，之后进行洗脱。采用此方法提取纯环二肽，提取步骤较少，操作简单，所得到纯环二肽的纯度更高，该方法所得环二肽属于纯天然产物，对环境友好，成本低，方法简单，可实现工业化生产。