本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种肉毒毒素的制备方法。包括以下步骤：合成编码肉毒毒素前体蛋白的多核苷酸序列；将核苷酸序列克隆到含有表达载体中，构建得到重组表达载体；将表达载体转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌工程菌，大肠杆菌选自可组成型表达二硫键异构酶且硫氧还蛋白还原酶和谷胱甘肽还原酶的基因失活的大肠杆菌，培养重组大肠杆菌工程菌，诱导表达肉毒毒素前体蛋白，经水解得到肉毒毒素。本发明未对肉毒神经毒素轻重链的序列进行任何优化和改动，将其完整序列全部插入表达质粒中，随后转化特定的大肠杆菌进行可溶性表达，保证了肉毒毒素的活性，简化了制备步骤。