本发明公开了一种微生物发酵制备N‑乙酰氨基葡萄糖的方法，涉及生物发酵工程技术领域。本发明将大肠埃希氏菌种子液、阿萨希丝孢酵母种子液和恶臭假单胞菌种子液混合后，接种至发酵培养基中进行发酵，即得含有N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵液。本发明采用大肠埃希氏菌、阿萨希丝孢酵母和恶臭假单胞菌组合作为发酵菌剂用于制备N‑乙酰氨基葡萄糖，利用这三株菌的酶系组成和生理生化特点，可明显缩短N‑乙酰氨基葡萄糖的发酵时间，还能抑制N‑乙酰氨基葡萄糖由胞外转移至胞内作为碳源被损耗，从而提高其产量。