本发明公开了一种鉴定烟草抗辣椒脉斑驳病毒的方法及应用，属于烟草抗病性筛选技术领域。本发明的方法是将待测烟草和感病对照播种育苗，待烟苗长至5～6片真叶时，在烟苗上部展开的叶片上接种含ChiVMV的接种液；接种后7～10天观察系统发病率；接种后21天，逐株调查发病级别；计算发病率、病情指数和抗性指数；根据一定的标准对待测烟草进行抗性评价。本发明通过毒株靶标性、接种一致性、材料高通量，来减少人为操作和识别误差，结果能够准确反映品种在田间的抗性水平。便于不同单位横纵结果可比性，适用于辣椒脉斑驳病毒的烟草苗期接种鉴定，特别适合从数量庞大的种质资源中筛选抗病品种。