本发明公开了一种DNA聚合酶链置换聚合活性的定量检测方法，通过设计链置换DNA聚合酶特异性分子信标MB，和与分子信标MB荧光量对等的探针标曲‑F1、探针标曲‑F2，利用不同浓度梯度探针和荧光增量建立标准曲线，并利用不同稀释浓度梯度的分子信标和荧光增量的关系，计算得到不同时间下不同稀释浓度链置换DNA聚合酶打开分子信标并释放荧光的分子信标量，然后建立分子信标打开量、链置换DNA聚合酶稀释倍数与时间的线性曲线，得到线性曲线的斜率K值，然后利用K值计算得到在37℃，30min打开1pmol分子信标所需的酶量。本发明的方法解决了现有技术存在的分析时间长，成本高，难以推广的问题。