本发明公开了一种分离纯化鼠李糖脂的方法。所述方法包含以下步骤：酸解鼠李糖脂发酵液，得到酸解液；酸解液中加入有机溶媒，获得萃取液，经相分离分别得到有机溶媒相、乳化相和水相；加入碱溶液处理有机溶媒相，经相分离获得的水相浓缩后为鼠李糖脂质量浓度≥50％，色谱纯度≥99％的高品质鼠李糖脂水溶液；任选地，加入破乳剂对乳化相破乳，固液分离得到清液，浓缩得到鼠李糖脂质量浓度≥10％，色谱纯度≥95％的低品质鼠李糖脂水溶液。同时可回收两种不同品质的鼠李糖脂产品，鼠李糖脂的回收率达到98％以上，色谱纯度大于99％或大于95％。