本发明公开了一种靶向甲型流感病毒核蛋白纳米抗体的制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明通过纳米抗体噬菌体文库构建、噬菌体筛选技术，获取1种抗甲型流感病毒核蛋白纳米抗体。所述抗甲型流感病毒核蛋白纳米抗体为VHH抗体，具有SEQ ID NO：1‑SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明公开的纳米抗体与甲型流感病毒核蛋白特异性结合，可应用于甲型流感病毒检测分析，对甲型流感病毒的流行或爆发的预警以及环境或人体中甲型流感病毒的检测等领域具有广阔的应用前景。