本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一种鉴定密斑刺鲀、大斑刺鲀和六斑刺鲀的方法。本发明提供的方法通过第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，直接根据PCR产物的有无就能对密斑刺鲀、大斑刺鲀和六班刺鲀的个体或者种群进行分子鉴定，无需进行送样测序，精确度高，周期短（1天内完成鉴定），成本低廉，可以实现高通量鉴定。可以取不同时期、不同来源的三种刺鲀的尾鳍组织，对动物损伤轻微或无损伤，也不需要个体养殖到一定重量，对养殖和生态保护均有帮助。