本发明公开了一种鉴别李氏重楼的方法、引物、探针及应用，涉及植物鉴定的技术领域，包括以下步骤：以待鉴别样品的基因组DNA为模板，采用引物D1‑F、D1‑R和探针D1‑probe进行实时荧光定量PCR扩增反应，检测CT值小于40，则鉴定为李氏重楼；所述引物D1‑F的序列如SEQ ID No.1所示，所述引物D1‑R的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针D1‑probe的序列如SEQ ID No.3所示。本发明具有极佳的特异性和灵敏度，能够对李氏重楼进行快速、可靠的鉴定。