本发明提供了一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用，属于分子生物学和生物医学领域。本发明将重组质粒、辅助质粒pCMV‑868CP和Opti‑MEM混合，然后与TransIT‑LT1转染试剂混合转染至BHK‑T7/9细胞中；将MA104N*V工程细胞株与转染的BHK‑T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。本发明通过反向遗传学体系，成功拯救出携带或不携带分子标记的轮状病毒(LLR)，以及重组轮状病毒(rLLR)。本发明拯救得到的重组病毒为外源基因表达奠定了基础，为轮状病毒抗病毒药物、疫苗中和抗体、联合疫苗及基因治疗等的研究和应用提供了工具和思路。