本发明公开了一种钼同位素三氧化钼‑100及其制备方法和应用。其中制备方法包括：步骤1：六氟化钼水解生成氟氧化钼、氧化钼和氟化氢；步骤2：水解产物氟氧化钼和氢氟酸等与碱发生中和反应，生成易溶于水的钼酸盐；步骤3：加入浓硝酸进行酸化，实现钼酸盐到钼酸的转化；步骤4：干燥煅烧得到高纯度三氧化钼‑100。收率达到80％以上，产品纯度≥99.9％，满足核工业、医学、物理学等领域的需求。产品以细粉末形态存在，可直接应用于后续应用之中。