本发明公开了一种用于同时检测SLC22A5基因16种致病突变的引物和探针组合及其应用。本发明所述引物和探针组合是针对SLC22A5基因上的16种常见致病突变位点，通过设计和反复的优化得到。在此基础上，本发明利用组合中的探针，制备得到了用于检测所述SLC22A5基因16种致病突变的基因芯片，结合修饰有生物素的引物，实现了SLC22A5基因致病突变位点的可视化检测，使得检测结果的呈现更为简洁、易读懂，降低了判读的复杂性。利用本发明所述引物和探针组合，还可以明确分辨出检测的突变位点是纯合还是杂合，具有较高的检测特异性，有助于对原发性肉碱缺乏症的筛查和鉴别。