本发明公开了一种短小芽孢杆菌突变株Y4m产酯化酶培养基优化方法，涉及微生物培养技术领域，其技术方案要点是：配置液体发酵培养基并设计相关实验确定最佳发酵条件，同时设计实验得到酶活值最高时的对应因素的实验结果，利用实验设计软件进行试验表格设计，筛选得到试验结果，通过对试验结果进行数据分析，建立二次响应面回归模型，得到模型的方差分析结果，根据方差分析结果的最大值找到对应因素的优化值，用以生成最佳发酵培养基。该发明通过设计相关实验得到了酶活值最高时的对应因素的实验结果，同时利用实验设计软件对实验结果进行筛选和分析，获得对应因素的优化值，便于配置最佳发酵培养基，用以培养脂化酶开展酶学特性的深入研究。