一种检测尼古丁的试纸条及其应用，该试纸条构成依次包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板。所述结合物释放垫上喷涂有胶体金标记的尼古丁特异性抗体。尼古丁特异性抗体是以尼古丁‑半抗原载体蛋白偶联物作为免疫原获得。尼古丁半抗原是从8种尼古丁半抗原中优选而来，筛选原则以分子刚性结构和免疫学经验为依据，对比了尼古丁5号位上不同取代基团的半抗原结构，优选氨基半抗原‑5。本发明以胶体金标记抗体，采用免疫层析技术，实现对样本中的尼古丁快速免疫分析。本发明还提供一种应用上述试纸条同时检测样品中尼古丁的方法。本发明的优点是灵敏度高、检测快速、操作方便，经济实用，能够实现对大批量的样品进行快速检测和现场检测。