本发明属于肌醇生物合成的技术领域，公开了一种肌醇‑3‑磷酸合成酶突变体及制备方法、构建体及构建方法、复合酶剂、应用及肌醇制备方法。本发明提供的肌醇‑3‑磷酸合成酶突变体与原始肌醇‑3‑磷酸合成酶相比具有T261P突变、A274R突变和I367Y突变中的一种或多种，且所述原始肌醇‑3‑磷酸合成酶包括序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸片段或与SEQ ID NO:1所示序列具有至少80％同源性的变体序列。本发明提供的肌醇‑3‑磷酸合成酶突变体具有强底物结合能力和高催化活性，能够与肌醇单磷酸酶以及任选的麦芽糊精磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶共同作用，实现肌醇的高原料转化率、高产量的体外非发酵生物合成，应用前景良好。