本发明涉及蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种耐高温蛋白酶突变体。所述突变体包含至少一个选自F13K、P42K、N58K、V60P、H63K、Q84K、K90G、R96S、L97F、T104K、H111V、F112V、Y114L、V128Q、I130A、L165I、K189P、A190T、K193L、E221N、T223F、H240E、G247N/C、K251T、I259T、K265C、Y266C、M268S、S297C、N301C、T304N、A310C、V312C、N317C、F325C、R331C、V342C、V345C、Q360C、S377C、D379C、T381C、A394C、N397C、N400C、Q401C、P402C、G403C、S408C、D418C、W422C、I428C、S439C、P447C、N452C、R454C、D460C、G465C、V467C、P474C、I482C、A490C、A497C、L502C、S507C、K512C、A514C、W535C所述突变位点的蛋白酶突变体。与野生型蛋白酶VL01相比，所述突变体的耐热性得到显著提高，有利于促进其在洗涤、饲料等工业领域中的广泛应用。