本发明公开了一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因型的方法及检测试剂盒。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因型的方法及检测试剂盒。本发明提供的试剂包括引物组1、引物组2或/和引物组3，引物组1由1对特异PCR扩增引物和2条单碱基延伸引物组成，检测链霉素rpsl基因型；引物组2由1对特异PCR扩增引物和4条单碱基延伸引物组成，检测链霉素rrs基因型；引物组3由1对特异PCR扩增引物和1条单碱基延伸引物组成，检测二线注射类药物rrs基因型。本发明用于快速、简单、高效地检测结核分枝杆菌链霉素和二线注射类药物耐药基因型，具有广泛的应用前景。