本发明属于功能高分子新材料技术领域，公开了一种壳聚糖衍生物抑菌液及其制备方法和应用。所述制备方法为：在保护气的气氛下，将壳聚糖溶胀后进行磺化，获得磺化壳聚糖；于水中，使磺化壳聚糖与2,3‑环氧丙基三甲基氯化铵进行季铵化反应，以在磺化壳聚糖上引入季铵盐基团，获得壳聚糖衍生物；将壳聚糖衍生物分散于水中后经辐射灭菌，即获得所述壳聚糖衍生物抑菌液。本发明的制备过程绿色无污染，有利于工业化生产，进而能够促进壳聚糖在作为生物抑菌液使用；且本发明制得的壳聚糖衍生物抑菌液不仅具有较宽的pH值适用范围，对不同细菌的抑菌性还表现出较高的选择性。