本发明公开一种多重PCR靶向捕获测序试剂盒及其应用，用于遗传性耳聋基因检测，包括Primer pool T1和Primer pool T2用于同时扩增一个或多个目标DNA区域；IGT‑EM808聚合酶混合物用于提高扩增效率和特异性；增强剂缓冲液Enhancer buffer NB(1N)和Enhancer buffer M，用于优化扩增反应；YF buffer B用于后续的纯化步骤；TPE1.0和TPE2.0索引系统用于区分不同的样本。本发明多重PCR靶向捕获测序试剂盒采用两轮PCR反应进行文库构建，可能提高了文库构建的周期短、覆盖率高、比对率高、捕获率高、均一性好、重复性好。