本发明涉及一种间充质细胞3D球的玻璃化冻存方法。包括冻存液配制、复苏液配制、人脐带来源间充质干细胞3D培养、降温程序、升温程序、微流控操作、细胞毒性检测、细胞存活率/增殖能力检测，以及体内实验检验功能性等。本发明采用微流控技术用材料包裹细胞3D球，用DMSO、乙二醇配制冻存液，用DMSO、乙二醇和蔗糖配制复苏液，以达到更好的冻存效果，复苏后存活率可达到95％。本发明利用微流控降低了操作过程中对细胞球造成的物理损害，利用冻存液减少冰结晶对细胞的损伤，确保冻存后人脐带来源间充质细胞依然有较高的存活率和功能性。