本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种以葡萄糖为底物从头合成胞磷胆碱的重组工程菌、制备方法及应用。本发明所提供的重组工程菌具体是：以BS168N为出发菌，首先将S.cerevisiae来源的磷脂酰乙醇胺N‑甲基转移酶基因PEM1和磷脂酰‑N‑乙醇胺N‑甲基转移酶基因PEM2整合到BS168N的基因组上进行诱导表达，打通磷脂酰乙醇胺到磷脂酰胆碱的合成通路；随后，将S.cerevisiae的CKI和CCT基因继续整合到表达PEM1‑PEM2的BS168N基因组上，打通胆碱到CDPC的合成通路，获得所述的重组工程菌，进一步将该重组工程菌进行摇瓶发酵，即可实现以葡萄糖为底物从头合成胞磷胆碱。本发明的方法为将来工业上通过合成生物学手段，构建从头高效合成胞磷胆碱的细胞工厂提供了基础研究和理论依据。