本发明提供了一种鉴定刀鲚与短颌鲚的引物组、试剂盒、检测方法与应用，属于分子标记鉴定技术领域。针对刀鲚与短颌鲚的卵、仔鱼和成体形态学差异不明显的缺陷与不足，本发明通过比对刀鲚、短颌鲚视蛋白基因上的序列差异，设计引物对A或引物对B进行基因扩增，通过比较扩增后序列差异来对刀鲚与短颌鲚进行鉴别。刀鲚和短颌鲚扩增产物的序列存在明显差异，可以通过分子标记对刀鲚类型进行分类，不用通过测序手段，直接以凝胶电泳图的形式直观反应结果，更快速准确地鉴别刀鲚与短颌鲚。该方法操作简单、结果直观，一天即可完成所有工作，无需统计，对实验设备要求低，成本低。