本发明公开了一种复合载体固定化脂肪酶及其制备方法和应用，所述复合载体固定化脂肪酶的制备方法包括如下步骤：S1.将含羧基的聚酮与酰氯化试剂反应，得酰氯化聚酮，加入三乙胺和3‑噻吩甲酸反应，得含噻吩取代基的聚酮；S2.将含噻吩取代基的聚酮、Fe3O4磁性纳米颗粒与戊二醛溶液反应，得磁性纳米颗粒复合载体；S3.将磁性纳米颗粒复合载体、脂肪酶溶液和戊二醛溶液反应，得复合载体固定化脂肪酶；本发明的复合载体固定化脂肪酶的制备方法制得的复合载体固定化脂肪酶的活性高、稳定性好，且在催化甘油解反应制备甘油二酯时，大大降低甘油一酯的含量。