本发明公开了一种腺病毒末端反向重复序列的克隆方法，包括如下步骤：（1）基因组提取：采用经典方法提取腺病毒基因组DNA，并使用Nanodrop测定DNA浓度；（2）酶切消化；（3）去除末端蛋白；（4）复性处理；（5）环化连接；（6）PCR扩增；（7）克隆与测序：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收特定大小的DNA片段，并用TE缓冲液洗脱溶解，随后将片段克隆至pCE3‑blunt载体中，转化TOP10大肠杆菌，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，并对阳性克隆进行测序。本发明提高了克隆效率，减少了操作步骤，增强了特异性，减少了错误克隆的可能性，扩大了应用范围，能够应对未知或新发的腺病毒。