本发明属于农业生物技术应用领域，具体涉及一种烟草二氯喹啉酸抗性基因及其应用，烟草二氯喹啉酸抗性基因Ko‑IAA16的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，烟草二氯喹啉酸抗性基因Ko‑IAA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述基因及其编码的蛋白应用于提高或增强烟草二氯喹啉酸抗性，并提供创制方法制备抗二氯喹啉酸的烟草植株。本发明利用基因编辑技术编辑烟草中NtIAA基因，干扰其在二氯喹啉酸胁迫下的表达和功能，从而提高烟草对二氯喹啉酸的抗性，创制具有二氯喹啉酸抗性的烟草种质资源。