本发明公开了一种由低含量维生素D3粗油回收制备维生素D3的方法，包括：(1)将低含量维生素D3粗油、酰氯化合物与非极性溶剂A混合，经酯化反应后制备得到维生素D3酯化液；(2)将所述维生素D3酯化液经色谱柱进行层析分离，得到高含量维生素D3酯化液；(3)将所述高含量维生素D3酯化液与碱性物质进行水解反应得到维生素D3精油，再经结晶得到维生素D3结晶。本发明的制备方法，尤其针对在以2000万iu/g维生素D3粗油为原料制备4000万iu/g维生素D3时最后剩余的、维生素D3效价仅为600～1200万iu/g的低含量维生素D3母液，以其为原料，成功制备得到4000万iu/g维生素D3，变废为宝，实现高价值地利用。