本发明公开一种耐受甲醇的高产α‑亚麻酸的毕赤酵母工程菌及其构建方法和应用，属于生物技术领域。本发明在毕赤酵母中筛选了膜磷脂相关基因，利用代谢工程和组学分析技术，构建并优化磷脂酰胆碱合成的途径，并过表达三酰甘油脂肪酶TAG基因，得到耐受甲醇的高产α‑亚麻酸的毕赤酵母工程菌株。在发酵罐水平添加5％的初始甲醇浓度，对高产α‑亚麻酸的毕赤酵母工程菌进行非灭菌发酵；其中，工程菌34在58h的OD600达到最高108.28，最高α‑亚麻酸的含量可以达到72.72g/L。本发明得到的高产α‑亚麻酸的毕赤酵母工程菌株具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。