本发明提供了一种检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用，所述试剂盒包括捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、血小板反应缓冲液。本发明提供的试剂盒，通过优化抗人IgG抗体的序列，在抗人IgG抗体溶液中添加封闭剂，添加捕获抗体微球混合液，以及改进血小板裂解液、血小板反应缓冲液的配方，可一次性检测五种特异性抗体，显著提高试剂盒的检测效率和准确度，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本，检测结果具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数不大于5％，批间实验的变异系数不大于8％。