本发明涉及微生物基因改造技术，公开了一种灰霉菌启动子文库、重组载体、重组菌以及它们的应用。该启动子文库含有不同强度的启动子Pthi4、P30hs、Ptef、P70hs、Phy1、P90hs、Paba1、Phy2、Phy3、Pfes1、Pyqae、Pgdh、Pory、Phy4、Psis1、Phs、Pcole1、Prcf2、Phy5、Phy6、Pexp、Prcn1、Pthid、Phy7、Phy8、PbZIP、Phy9、Phy10、Phy11和Phy12，核苷酸序列依次如SEQ ID NO. 1‑30所示。本发明提供的启动子文库不仅能够较高地调控目的基因表达强度，而且大大丰富了灰霉菌的启动子遗传调控元件，有利于优化灰霉菌的工业化应用。