本发明提供一种咪唑乙烟酸原药中未知杂质的分离方法，原药的前处理：称取适量咪唑乙烟酸原药用碱溶液溶解，通过搅拌反应，得到含有未知杂质的咪唑乙烟酸盐水溶液；杂质的制备：将含有未知杂质的咪唑乙烟酸铵盐水溶液过滤及洗涤，制备得到未知杂质。本发明的另一目的是根据所述分离方法所得咪唑乙烟酸原药中未知杂质的鉴定方法，通过HPLC‑MS、FTIR、XPS、EA、或NMR中的一种或多种进行分析鉴定杂质为5‑乙基‑2‑(5‑异丙基‑5‑甲基‑4‑氧代‑4,5‑二氢‑1H‑咪唑‑2‑基)‑N‑苯基烟酰胺。