本申请属于免疫检测技术领域，公开了一种睾酮夹心法兔单克隆抗体及其应用。本申请提供的睾酮夹心法单克隆抗体mAb2，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的LCDR1包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，LCDR2包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，LCDR3包含如SEQ ID NO:3所示的序列；所述重链可变区的HCDR1包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，HCDR2包含如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，HCDR3包含如SEQ ID NO:6所示的序列。本申请的单克隆抗体可与睾酮复合物高特异性结合，适用于双抗夹心法免疫检测，将其应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中，双抗体夹心化学发光平台检测睾酮标准抗原，检测灵敏度低于0.5ng/ml，磁化学发光法检测临床样本，在0.4‑16ng/mL样本范围内，和临床比对相关性良好。