本发明涉及氨基酸含量的测定，特别是指一种改进的用于制革脱毛水解液中羟脯氨酸含量的测定方法。本发明是将待测样本经前处理后获得水解产生包含游离羟脯氨酸的待测水解液，待测水解液中的游离羟脯氨酸被氯胺T氧化为吡咯，吡咯与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，产物在560nm处具有特征吸收峰，通过吸光值的变化定量检测羟脯氨酸的含量。本发明通过对待测水解液中除HYP之外影响测定结果的干扰因素进行有效排除与控制，有效提高测量结果的精确度，使HYP含量的精确测定更好服务于制革酶脱毛质量的科学评价。