本发明公开了一种NMNAT‑Ppase共固定化酶的制备方法及其在辅酶I生产工艺中的应用。本发明公开的NMNAT‑Ppase共固定化酶的制备方法主要为，中性条件下，将NMNAT酶通过酶上的氨基与氨基环氧载体中的环氧官能团反应，并使用封闭剂对氨基环氧载体上未反应的环氧官能团进行封闭，得到链接了NMNAT酶的载体；然后将其加到戊二醛水溶液中，通过席夫碱反应对载体进行修饰；再将修饰后的载体加入到Ppase酶液中，在特定温度和反应时间下，通过席夫碱反应将Ppase酶固定化；最后将已经链接了NMNAT酶和Ppase酶的载体在还原剂作用下进行还原反应得到NMNAT‑Ppase共固定化酶。本发明通过制备NMNAT‑Ppase共固定化酶并将其应用于辅酶I的生产工艺中，解决了辅酶I生产效率低、成本高和无法实现连续化的问题。