本发明提供了一种用于天然PAM缺失的结核耐药突变的CRISPR‑Cas12检测方法及应用。CRISPR‑Cas12耐药基因突变检测体系的使用前提是在识别序列附近存在PAM序列，但部分耐药突变位点附近并不存在天然PAM序列，极大地限制CRISPR‑Cas12耐药基因突变检测体系的应用。本发明包括用于结核分枝杆菌耐药基因高效扩增的巢式PCR引物组、用于在指定位置插入PAM序列的巢式PCR引物组和sgRNA，可用于制备检测或辅助检测耐多药结核分枝杆菌的利福平耐药性试剂盒，方便进行包括结核分枝杆菌常见耐药基因，例如rpoB基因的耐药突变位点检测，降低检测成本，具有良好的应用前景。