本发明提供了一种蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶、酵母工程菌及构建方法与应用，属于基因工程技术领域，主要提供了一种重组透明质酸酶，所述重组透明质酸酶氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；一种酵母工程菌，构建酵母工程菌时在酵母菌中导入所述重组透明质酸酶的编码基因，使用pPIC9K载体，pPIC9K载体中的信号肽α‑factor替换为sp23信号肽；本发明首次利用酵母菌成功表达了棕色蜘蛛毒液来源的重组透明质酸酶，为实际应用增加了透明质酸酶的多样性，提高市场竞争力。