本申请提供了抗GAD65抗体及其应用，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的HCDR1，如SEQ ID NO:3所示的HCDR2，和如SEQ ID NO:4所示的HCDR3；以及所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:6所示的LCDR1，如SEQ ID NO:7所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:8所示的LCDR3。经过细胞免疫荧光、组织免疫荧光及蛋白质免疫印迹方法的验证，本发明得到的抗GAD65单克隆重组抗体可以特异性识别不同形式的GAD65抗原，用于多种实验用途。