本发明属于硫酸软骨素生物合成的技术领域，公开了一种高产硫酸软骨素的重组菌株及其应用和硫酸软骨素的制备方法。本发明提供的重组菌株能够同时表达UDP‑氨基葡萄糖异构酶、UDP‑葡萄糖脱氢酶、软骨素聚合酶、氨基葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖‑6‑磷酸异构酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖‑1‑磷酸尿苷酰转移酶、ATP磺化酶、磺基转移酶、丙酮酸激酶以及APS激酶，上述酶分子配合以重组菌株细胞内原有的碳代谢途径共同构成了具有高效合成CSA能力的酶联级路径，能够实现CSA的高产量以及高纯度的制备，具有操作简便、所得产品生物安全性高以及易于实现大规模生产等优点，应用前景良好。