本发明涉及葡萄糖检测技术领域，公开了一种d‑核糖发酵液中葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：步骤一、将d‑核糖发酵液样品稀释并调整至预定pH值，形成预处理样品；步骤二、通过固相萃取去除杂质并浓缩目标组分，获得处理后的样品；步骤三、利用高效液相色谱对样品进行分离，设置流动相、流速和色谱柱温度，分离得到葡萄糖组分；步骤四、将分离得到的组分在线注入质谱系统，检测葡萄糖的特征离子信号。通过采用高效液相色谱与质谱联用技术，能够实现对d‑核糖发酵液中葡萄糖的高灵敏度和准确检测。通过优化的样品预处理和流动相选择，减少了其他糖类物质对葡萄糖检测的干扰，确保了葡萄糖浓度的精确测定。