本发明涉及使用标记的底物或底物类似物测定靶的改进方法，所述方法包括在酶-催化的反应中使所述底物或底物类似物进行反应，仅当底物或底物类似物反应时，产生带有独立地可测定信号的标记部分。本发明特别公开了测定样品中核酸的方法，所述方法基于使用末端-磷酸根-标记的核苷酸作为核酸聚合酶的底物。本发明方法使用核苷多磷酸酯、二脱氧核苷多磷酸酯或脱氧核苷多磷酸酯类似物，它们具有连接于末端磷酸根上的生色染料、化学发光或荧光部分、质量标记或电化学标记。当核酸聚合酶使用这些类似物作为底物时，酶-活化的标记将存在于磷酰基转移的无机多磷酸酯副产品中，磷酰基转移的多磷酸酯产品通过磷酸酯酶的断裂导致其上连接的标记中的可测定变化，当聚合酶试验在磷酸酯酶存在下进行时，提供了实时监测RNA或DNA合成和测定靶核酸的方便的方法。