一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XY n 。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XY n 信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干ΧΥ n 信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干ΧΥ n 信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。