L'invention concerne une méthode d'identification de particules biologiques au moyen d'une pile d'images holographiques obtenues au moyen d'un système optique. Une pile de blocs d'image centrés sur la particule biologique à analyser est extraite de la pile d'image et un bloc de référence correspondant au plan de mise au point est déterminé. Une grandeur caractéristique est calculée sur chaque bloc de la pile et le profil de cette grandeur caractéristique le long de l'axe optique du système est comparé à une pluralité de profils type relatifs à des types de particule connus. Alternativement des blocs de la pile pour des écarts de défocalisation prédéterminés sont extraits de la pile de blocs et les blocs ainsi extraits sont comparés à des blocs type relatifs à des types de particule connus.