公开(公告)号：CN103060366A

公开(公告)日：2013-04-24

申请号：CN201210569965.3

申请日：2012-12-25

申请人： 武汉科技大学

发明人： 张同存 ,  周俊 ,  戴永刚 ,  王震宇 ,  吴尘宇 ,  成采莲 ,  唐文心

IPC分类号： C12N15/81 ,  C07K14/745 ,  C12R1/84

摘要： 本发明公开了人凝血因子Ⅸ毕赤酵母表达载体及构建方法和应用，其步骤是：根据hFIX基因序列，用RT-PCR技术从人肝细胞中中克隆出hFIX全长cDNA序列，构建用于毕赤酵母表达的融合了酵母α-factor信号肽和全长hFIX序列的酵母表达质粒pPIC9K-hFIX。继而构建酵母表达质粒pPICZαA-hFIX，在此基础上构建四种酵母菌hFIX高活性突变体。得到的hFIX酵母表达载体凝血活性明显高于标准hFIX。其中一种突变体经50L中试发酵研究，蛋白纯化产物分泌表达量为702mg/L，为以后低成本产业化生产治疗B型血友病的高效hFIX产品打下了良好的基础。

公开(公告)号：CN103173482A

公开(公告)日：2013-06-26

申请号：CN201110435501.9

申请日：2011-12-22

申请人： 武汉科技大学

发明人： 张同存 ,  周俊 ,  王震宇 ,  戴永刚 ,  成彩莲 ,  唐文心

IPC分类号： C12N15/81 ,  C07K14/745 ,  C12P21/02 ,  C12R1/84

摘要： 本发明公开了一种野生型和三种突变体hFⅨ在毕赤酵母中的表达载体的构建方法及应用，其步骤：根据Genebank提供的基因序列，用RT-PCR技术从健康人肝脏中克隆出hFⅨ全长cDNA序列，构建用于毕赤酵母表达的融合了酵母α-factor信号肽和全长hFⅨ序列的酵母表达质粒pPIC9K-hFⅨ，将该质粒转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌株。继而构建酵母表达质粒pPICZA-hFⅨ，在此基础上设计并构建三种酵母菌hFⅨ高活性突变体，电转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌突变株。得到的各种hFⅨ酵母表达载体凝血活性均高于标准hFⅨ。野生型hFIX(pPIC9K-hFⅨ)经50L中试发酵研究，蛋白纯化产物分泌表达量最高可达558mg/L，纯度和凝血活性均较高。