公开(公告)号：CN119752971A

公开(公告)日：2025-04-04

申请号：CN202510041609.1

申请日：2025-01-10

Applicant: 福州大学

Inventor： 范立海 ,  陈伟香 ,  郭强

IPC: C12N15/70 ,  C12P7/58 ,  C12N15/53 ,  C12N15/55 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种利用D‑木糖和甲醇生物合成D‑葡萄糖二酸的方法。目前，大部分研究者利用D‑葡萄糖六碳糖为底物制备D‑葡萄糖二酸。本发明在大肠杆菌中过表达mdh、hps、phi、ino1、suhb、miox和udh基因，构建一条由D‑木糖和甲醇生物合成D‑葡萄糖二酸的新途径；通过敲除frmRAB、rpiA、pfkA和pfkB基因，实现碳源的合理控制；结合适应性实验室进化方法、融合促溶标签、肌醇生物传感器提高生物合成途径的效率，最终实现D‑葡萄糖二酸的高效合成。

公开(公告)号：CN115976134B

公开(公告)日：2024-07-26

申请号：CN202211295091.7

申请日：2022-10-21

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  张亚星 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N1/21 ,  C12N15/61 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12N1/36 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。利用大肠杆菌JM109(DE3)为宿主，通过敲除基因fruA,mak,manXYZ，galE和经转录组测序筛选获得的D‑阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，同时引入外源D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因dpe以及表达第34位碱基g突变为t的果糖非特异性转运蛋白基因ptsG‑F构建重组菌株JM109(DE3)(DPE,PtsG‑F,ΔFruA,ΔMak,ΔManXYZ,ΔGalE，ΔFryA)。对该重组菌株进行高低温转换的控温发酵和补料分批发酵实现D‑阿洛酮糖的高效合成。

公开(公告)号：CN113801833B

公开(公告)日：2023-04-11

申请号：CN202111046434.1

申请日：2021-09-08

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  郭强 ,  郑辉东 ,  郑灵洁

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/61 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12N15/50 ,  C12P19/02 ,  C12P19/24 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。本发明利用dpe基因在大肠杆菌体内过表达，构建D‑果糖至D‑阿洛酮糖的代谢通路；再对大肠杆菌自身的fruA、manXYZ、mak三个基因进行敲除，有效缓解细胞对果糖的磷酸化作用，避免代谢底物的大量浪费；再过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因，建立果糖向包内快速转运的新途径，保证代谢底物的供给；然后敲除galE和fruK两个基因，利用Ni2+下调FbaA蛋白的功能性，加强对重组菌果糖代谢通量的控制，保证底物向D‑阿洛酮糖的最大转化效率。本发明所得的重组菌单细胞工厂可为D‑阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略。

公开(公告)号：CN115074376A

公开(公告)日：2022-09-20

申请号：CN202210459067.6

申请日：2022-04-28

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘晨阳 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P19/02 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种利用重组大肠杆菌发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。以大肠杆菌为底盘宿主菌，通过敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因FruA，同时过表达果糖非磷酸化转运蛋白基因pstG‑F、果糖激酶基因maK、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶基因alsE、阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶基因a6PP，建立从D‑果糖到D‑阿洛酮糖的合成途径；进一步敲除D‑果糖‑6‑磷酸激酶基因pfkA和pfkB，调控重组大肠杆菌的碳代谢通量；再过表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因pckA并以甘油为碳源，提高胞内ATP浓度。本发明构建的重组大肠杆菌用于发酵生产，可有效提高底物转化率，为生物合成D‑阿洛酮糖的工业化发展提供优化方案。

公开(公告)号：CN114231579A

公开(公告)日：2022-03-25

申请号：CN202210034802.9

申请日：2022-01-13

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 王莹淑 ,  高欣全 ,  郑辉东 ,  范立海

IPC: C12P19/24 ,  C12P19/02 ,  C12N11/10 ,  C12N11/04 ,  C12N9/90 ,  C07H3/02 ,  C07H1/06

Abstract: 本发明公开了一种连续、循环制备D‑阿洛酮糖的方法包括以下步骤：（1）用Tris‑HCl缓冲液配置10g/L D‑果糖溶液。（2）向D‑果糖溶液加入终浓度为1mM的Mn2+得到果糖底物。（3）对D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶进行固定化。（4）在串联填充床中填充固定化D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶作为催化剂和钙离子树脂。（5）通过蠕动泵将果糖底物输入到串联填充床装置中进行催化反应和吸附，（6）最后对填充柱进行脱附、冲洗，得到D‑阿洛酮糖。本发明是边反应边吸附制备D‑阿洛酮糖的方法，可以打破D‑果糖转化D‑阿洛酮糖的可逆反应平衡，消耗更多的底物，提高产率，同时反应时间短，固定化酶可重复使用，适合工业化生产。

公开(公告)号：CN113801833A

公开(公告)日：2021-12-17

申请号：CN202111046434.1

申请日：2021-09-08

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  郭强 ,  郑辉东 ,  郑灵洁

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/61 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12N15/50 ,  C12P19/02 ,  C12P19/24 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。本发明利用dpe基因在大肠杆菌体内过表达，构建D‑果糖至D‑阿洛酮糖的代谢通路；再对大肠杆菌自身的fruA、manXYZ、mak三个基因进行敲除，有效缓解细胞对果糖的磷酸化作用，避免代谢底物的大量浪费；再过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因，建立果糖向包内快速转运的新途径，保证代谢底物的供给；然后敲除galE和fruK两个基因，利用Ni2+下调FbaA蛋白的功能性，加强对重组菌果糖代谢通量的控制，保证底物向D‑阿洛酮糖的最大转化效率。本发明所得的重组菌单细胞工厂可为D‑阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略。

公开(公告)号：CN115466758B

公开(公告)日：2024-12-06

申请号：CN202211129170.0

申请日：2022-09-16

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  刘美茗 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N15/70 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供一种大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖发酵生产D‑阿洛酮糖的方法，利用大肠杆菌为宿主细胞，通过在野生大肠杆菌中表达外源基因甲醇脱氢酶Mdh、3‑己糖‑6‑磷酸合成酶Hps、6‑磷酸‑3‑己糖异构酶Phi、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶AlsE、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶A6PP，建立一条从甲醇和D‑木糖到合成D‑阿洛酮糖的路径。为提高AlsE蛋白的表达量引入蛋白标签SUMO。通过敲除副产物途径基因frmABR，磷酸戊糖途径的关键基因rpiA，以及糖酵解途径的关键基因pfkA，pfkB，得到一株重组菌株，实现碳源的理性控制，从而实现大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖高效合成D‑阿洛酮糖。

公开(公告)号：CN118127093A

公开(公告)日：2024-06-04

申请号：CN202410361286.X

申请日：2024-03-27

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  王培 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P17/10 ,  C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/60 ,  C12N15/70 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种利用大肠杆菌细胞工厂发酵合成麦角硫因的方法，旨在构建以甲硫氨酸、组氨酸和半胱氨酸为底物的新型大肠杆菌细胞工厂，实现麦角硫因的发酵合成。首先，以E.coli BL21(DE3)为宿主，利用pRSFDuet‑1和pACYCDuet‑1双质粒系统共表达组氨酸甜菜碱加氧酶（EgtB）、组氨酸N‑α‑甲基转移酶（EgtD）、半胱氨酸亚砜裂解酶（EgtE）、和S‑腺苷甲硫氨酸合成酶（MetK），构建麦角硫因的胞内合成途径；其次，依次对IPTG的量、温度、底物浓度发酵工艺进行优化，进一步强化细胞工厂的生产效率；最后，利用SUMO融合标签提高关键基因的表达水平，最终麦角硫因产量可达到81.9 mg/L。

公开(公告)号：CN116121308A

公开(公告)日：2023-05-16

申请号：CN202310255061.1

申请日：2023-03-16

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  马倩 ,  郑灵洁 ,  郭强 ,  郑辉东

IPC: C12P7/26 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N9/10 ,  C12N9/02 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种基于NADPH辅因子循环的级联酶催化高效合成四氢姜黄素的方法，旨在通过体外级联酶催化技术将姜黄素高效转化为四氢姜黄素。本发明利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞，表达NADPH依赖性姜黄素转化酶（CurA）以及甲酸脱氢酶（Fdh）。使用LB培养基进行发酵，超声细胞破碎以得到CurA和Fdh的粗酶液。NADPH依赖性的CurA负责将姜黄素转化为四氢姜黄素。Fdh负责将产生的NADP+还原为NADPH以实现NADPH辅因子的高效循环利用。此外，借助离子液体提高姜黄素在反应体系中的溶解度，通过底物以及离子液体浓度的优化最终姜黄素转化率约为40.5%，四氢姜黄素产率约为48.66%，产量约为11.01mg/L。

公开(公告)号：CN115976134A

公开(公告)日：2023-04-18

申请号：CN202211295091.7

申请日：2022-10-21

Applicant: 福州大学 ,  清源创新实验室

Inventor： 范立海 ,  张亚星 ,  郭强 ,  郑灵洁 ,  郑辉东

IPC: C12P19/02 ,  C12N1/21 ,  C12N15/61 ,  C12N15/54 ,  C12N15/31 ,  C12N1/36 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D‑阿洛酮糖的方法。利用大肠杆菌JM109(DE3)为宿主，通过敲除基因fruA,mak,manXYZ，galE和经转录组测序筛选获得的D‑阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，同时引入外源D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶基因dpe以及表达第34位碱基g突变为t的果糖非特异性转运蛋白基因ptsG‑F构建重组菌株JM109(DE3)(DPE,PtsG‑F,ΔFruA,ΔMak,ΔManXYZ,ΔGalE，ΔFryA)。对该重组菌株进行高低温转换的控温发酵和补料分批发酵实现D‑阿洛酮糖的高效合成。