一种鱼用浸泡疫苗组合佐剂及其应用和使用方法，其特征在于该组合佐剂分别是二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱的三种佐剂组合，其中二硫苏糖醇、维生素D3和消旋山莨菪碱的使用浓度分别为1-50mg/L、0.1-20mg/L和1-60mg/L，而应用于包括海水和淡水鱼类的浸泡疫苗中协同作用达到高效的免疫效果。使用时首先选用体重在每尾2g以上且体表完好的待免疫鱼类；将待免疫的鱼移入浓度范围为1-50mg/L的二硫苏糖醇预处理液中浸泡1-20min，再向其中加入浓度范围为0.1-20mg/L的VD3与疫苗浸泡2-20min，然后向其中加入浓度范围为1-60mg/L的消旋山莨菪碱浸泡5-20min即可。本发明显著提高疫苗的免疫效果，使用方法简便安全，成本低，无需额外设施与工序，且对鱼的存活率与生长速度无影响，对环境及操作人员同样无害。