本发明公开了一种头孢菌素酰化酶突变体及其编码基因与应用。本发明提供了的蛋白，为如下1)-3)中的任一一种：1)序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白；2)序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白；3)将序列表中序列3或序列4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有头孢菌素酰化酶功能的由1)衍生的蛋白。本发明的实验证明，本发明提供了一种野生型CPC酰化酶变体，通过HPLC结果表明本发明的野生型CPC酰化酶变体与野生型酶相比，对CPC的比活可提高6.5倍。在一步法转化中，在3h内，转化率达到98％以上。